Microaula em Método CELULA • Prévia Aberta

<p>Fundamentos estruturais e físico-químicos dos ácidos nucleicos aplicados à biologia molecular diagnóstica: conformação em dupla hélice do DNA genômico, estrutura secundária de RNAs (mRNA, rRNA, tRNA e microRNAs), ligações fosfodiéster, desnaturação térmica e temperatura de fusão (Tm); metodologias de isolamento, lise celular e purificação de DNA e RNA a partir de sangue total, tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (FFPE), raspados celulares e fluidos biológicos: métodos de extração por lise química/detergentes e purificação em colunas de sílica com centrifugação vs. automação por esferas magnéticas (nanopartículas paramagnéticas funcionalizadas); avaliação quantitativa e qualitativa dos extratos: espectrofotometria UV por NanoDrop com cálculo das razões de absorbância A260/A280 (pureza em relação a proteínas, ideal ~1,8 para DNA e ~2,0 para RNA) e A260/A230 (contaminação por solventes orgânicos, fenol e sais caotrópicos, ideal &gt; 2,0), e fluorometria por Qubit para quantificação absoluta por corantes seletivos. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): princípios da amplificação enzimática in vitro, DNA polimerases termoestáveis (Taq polimerase e enzimas de alta fidelidade Proofreading com atividade exonuclease 3&#x27;-5&#x27;), reagentes de reação (dNTPs, cloreto de magnésio, primers oligonucleotídicos senso e antissenso com desenho de termodinâmica e especificidade); PCR convencional de ponto final vs. RT-PCR com transcriptase reversa para amplificação a partir de moldes de RNA; PCR em tempo real quantitativa (qPCR / RT-qPCR): monitoramento cinético da fluorescência ciclo a ciclo, químicas de detecção por agentes intercalantes inespecíficos (SYBR Green) com curva de dissociação térmica (Melt Curve) para validação de amplicon único versus químicas fluorogênicas de hidrólise com sondas fluorescentes específicas TaqMan (Fluoróforo repórter FAM/VIC e Quencher não fluorescente TAMRA/MGB); análise matemática do limiar de detecção (Cycle Threshold - Ct / Cq), curvas de calibração padrão para quantificação absoluta de carga viral (cópias/mL ou UI/mL em HIV, HCV e HBV) e método comparativo Delta-Delta-Ct (2^-ddCt) para quantificação relativa de expressão gênica com genes de referência endógenos (GAPDH, ACTB); e reações multiplex para detecção simultânea de múltiplos patógenos. Tecnologias de sequenciamento genético: sequenciamento de primeira geração pelo método enzimático de terminação de cadeia de dideoxinucleotídeos marcados por fluorescência de Sanger (eletroferograma capilar, leitura de picos e padrão-ouro para variantes pontuais) vs. Sequenciamento de Nova Geração (NGS / Next-Generation Sequencing): plataformas de sequenciamento por síntese (Illumina), pirosequenciamento e sequenciamento de terceira geração por nanoporos (Oxford Nanopore); fluxo de trabalho em NGS: fragmentação do DNA, preparo de bibliotecas genômicas com ligação de adaptadores e códigos de barras moleculares (índices), enriquecimento por amplificação em ponte ou emulsão PCR, sequenciamento massivo em paralelo, geração de leituras brutas (arquivos FASTQ), alinhamento contra genoma de referência (arquivos BAM/SAM), chamada de variantes (VCF) e análise bioinformática para identificação de variantes genéticas e mutações de resistência farmacológica.</p>

Fundamentos estruturais e físico-químicos dos ácidos nucleicos aplicados à biologia molecular diagnóstica: conformação em dupla hélice do DNA genômico, estrutura secundária de RNAs (mRNA, rRNA, tRNA e microRNAs), ligações fosfodiéster, desnaturação térmica e temperatura de fusão (Tm); metodologias de isolamento, lise celular e purificação de DNA e RNA a partir de sangue total, tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (FFPE), raspados celulares e fluidos biológicos: métodos de extração por lise química/detergentes e purificação em colunas de sílica com centrifugação vs. automação por esferas magnéticas (nanopartículas paramagnéticas funcionalizadas); avaliação quantitativa e qualitativa dos extratos: espectrofotometria UV por NanoDrop com cálculo das razões de absorbância A260/A280 (pureza em relação a proteínas, ideal ~1,8 para DNA e ~2,0 para RNA) e A260/A230 (contaminação por solventes orgânicos, fenol e sais caotrópicos, ideal > 2,0), e fluorometria por Qubit para qua...