← Ver trilha completa Genômica e Proteômica na Pesquisa em Biologia Oral: Sequenciamento de Nova Geração (NGS), Metagenômica, Espectrometria de Massas e Biologia de Sistemas

Célula 01: Sequenciamento de Nova Geração (NGS), WGS e Transcriptômica de Célula Única (scRNA-seq) na Cavidade Oral

Estudo teórico, bioinformático e experimental das tecnologias de sequenciamento de DNA e RNA de alto rendimento no complexo oral: 1. A Evolução do Sequenciamento Genômico: da eletroforese capilar de Sanger ao sequenciamento massivo paralelo de segunda geração (Illumina: sequenciamento por síntese SBS com clusters em flow cells reversíveis) e terceira geração (Pacific Biosciences HiFi de moléculas únicas e Oxford Nanopore ONT baseado em corrente iônica através de nanoporos proteicos); 2. Aplicações de WGS (Whole Genome Sequencing) e WES (Whole Exome Sequencing): mapeamento de mutações raras em malformações craniofaciais congênitas e detecção de variantes somáticas (SNVs, pequenas inserções/deleções InDels e variações no número de cópias - CNVs) no Carcinoma Espinocelular Oral (CECO); 3. Transcriptômica Global (Bulk RNA-seq): fluxo de trabalho desde a extração de RNA de alta integridade (RIN > 8,0), enriquecimento de mRNA por captura de caudas poli-A versus ribo-depleção de RNA ribossomal (total RNA-seq), construção de bibliotecas de cDNA pareadas (paired-end), alinhamento contra o genoma humano de referência (GRCh38) com STAR/HISAT2 e normalização estatística de contagens (TPM, FPKM e modelos de dispersão binomial negativa com DESeq2 e edgeR); 4. A Revolução da Transcriptômica de Célula Única (scRNA-seq): superação das limitações do RNA-seq em massa (bulk), que mascara a heterogeneidade fenotípica média; isolamento celular viável a partir de biópsias gengivais e mucosas; tecnologia de microfluídica baseada em gotículas emulsificadas em óleo (plataforma 10x Genomics Chromium); encapsulamento de células individuais com microesferas de gel contendo códigos de barras celulares (*cell barcodes*) e identificadores moleculares únicos (*UMIs*); e 5. Pipeline Bioinformático de scRNA-seq no R (pacote Seurat): controle de qualidade (filtragem de doublets, células apoptóticas com alto percentual mitocondrial > 10% e baixo número de genes), normalização por regressão, seleção de genes de alta variabilidade, redução linear de dimensionalidade (PCA), agrupamento não-supervisionado por grafos de vizinhança (Louvain/Leiden), visualização não-linear por UMAP e t-SNE, e anotação automatizada de clusters celulares através de marcadores canônicos (subpopulações de ceratinócitos basais, fibroblastos gengivais heterogêneos, endotélio e infiltrados de células imunes na saúde e na doença periodontal).

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1. Circunstância (O Desafio no Mundo Real)

<p>Um consórcio de pesquisa oncológica e biologia oral translacional estuda amostras de biópsia fresca de Carcinoma Espinocelular Oral (CECO) de borda de língua pareadas com tecido mucoso adjacente clinicamente normal. O objetivo é desvendar a heterogeneidade intratumoral, a plasticidade epitélio-mesênquima das células neoplásicas e o microambiente imunológico imaturo que favorece a invasão estromal. O bioinformata e biólogo molecular precisa processar a suspensão celular viável na plataforma 10x Genomics Chromium, executar o sequenciamento scRNA-seq em um Illumina NovaSeq 6000 gerando mais de 50.000 reads por célula, conduzir o controle de qualidade e filtragem no Seurat, mapear as trajetórias ontogenéticas de diferenciação celular por pseudotempo (Monocle 3) e identificar os marcadores moleculares de subpopulações resistentes a quimioterápicos.</p>

2. Fundamentos & Conceito Central (Estudos)

A introdução das plataformas de Sequenciamento de Nova Geração (NGS - Next-Generation Sequencing) transformou irreversivelmente a pesquisa em biologia oral e ciências odontológicas. A capacidade de decodificar bilhões de pares de bases em uma única corrida permitiu a transição de estudos focados em genes isolados para a análise holística e imparcial de genomas e transcriptomas completos, desvendando as assinaturas moleculares do desenvolvimento craniofacial, das infecções periodontais e da carcinogênese estomatológica.

1. Plataformas de Sequenciamento e Aplicações Genômicas (WGS/WES)

O ecossistema contemporâneo de sequenciamento celular divide-se em duas abordagens complementares:

Plataformas de Segunda Geração (Short-Reads): A tecnologia Illumina domina a genômica quantitativa através do sequenciamento por síntese (SBS). O DNA genômico é fragmentado (200-500 pb), ligado a adaptadores universais e amplificado por PCR em pont...

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